Các hãng hàng không lớn sử dụng máy bay 727 có AeroSur, Air Vietnam, Aerolíneas Argentinas, Aerolíneas Internacionales, Air Canada, Air France, Air Malta, ANA, Alitalia, American, Ansett, ASTAR, ATA Airlines, Avensa, Avianca, Aviacsa, Braniff International, China Airlines, Continental Airlines, Continental Micronesia, Copa, CP Air, Delta Air Lines, Dominicana, Eastern Air Lines, FedEx, First Air, Iberia, Iran Air, Japan Airlines, JAT, Korean Air, Lloyd Aereo Boliviano, Lufthansa, Mexicana, Northeast Airlines, Northwest Airlines, Olympic Airways, Pan Am, People Express, Philippine Airlines, Pride Air, Royal Air Maroc, Sabena, Singapore Airlines, South African Airways, TAA, Transbrasil, United Airlines, US Airways, Varig, VASP, Viasa, Western Airlines và, trong số các hãng hàng không thuê bao, Carnival Air Lines, Tame và Hapag-Lloyd.

Vào tháng 8 năm 2006, tổng số 620 chiếc Boeing 727 (tất cả các biến thể) vẫn còn được các hãng hàng không vận hành. Các hãng vận hành 727 lớn có: FedEx (104), United Parcel Service (33), Libyan Arab Airlines (10), Astar Air Cargo (29), Capital Cargo International Airlines (13), Cargojet Airways (14), Champion Air (16), Custom Air Transport (17), Kelowna Flightcraft (16), Kitty Hawk Aircargo (28), Transafrik (11), Hewa Bora Airways (11) and Lloyd Aereo Boliviano (12).[2] Some 104 other airlines also operate smaller numbers of the type.[2]

Zero-Gravity Corporation sử dụng máy bay Boeing 727 cải hoán để cung cấp cho khách hàng một trải nghiệm ngắn về tình trạng không trọng lực, giống như Mũ Nôn mửa của NASA được sử dụng để huấn luyện những nhà du hành vũ trụ. Ngoài ra, máy bay 727 thỉnh thoảng được chính phủ sử dụng, bay cho các không lực của Bỉ, Nam Tư, México và New Zealand, trong số các nhóm nhỏ thuộc chính phủ đã sử dụng máy bay này. Quân đội Mỹ đã sử dụng 727 làm máy bay vận chuyển quân sự. Nó được đặt tên là C-22. Chiếc 727 chuyên chở thủ tướng New Zealand Jim Bolger được gọi là Spud One. Các máy bay 727 thuộc Không lực New Zealand đã được thay thế bằng những chiếc 757.